La chapelle est un édifice chrétien des plus anciens à Nîmes puisque les trois travées de la nef sont d'époque romane, peut-être du 10e siècle. Les archives confirment l'existence d'une église Sancte Eugenie dès 995. Le choeur est daté du 15e siècle.

Dans l'unique paroisse de Nîmes au Moyen Age, Sainte-Eugénie fait partie des rectories, églises dont le service liturgique est assuré par des prêtres désignés par le chapitre cathédral. Les protestants s'emparent de l'église fin 1561, en font un magasin à poudres. Puis l'église et son petit cloître sont vendus en 1569 à Pierre Albenas et Jean Sabatier. Le culte reprend le 18 janvier 1657 et à partir de ce moment-là est fort important.

Le 21 mars 1792, l'église est vendue à un particulier et passe dans plusieurs mains durant le 19e siècle. Mgr Plantier veut racheter la chapelle, ce qui réussit finalement en 1875. Le restaurateur de la chapelle, qui était devenue une fabrique de billards, est l'abbé Siméon Couran (1834-1900). Il avait fondé l'oeuvre des Servantes pour des femmes venues des montagnes à Nîmes pour trouver du travail.

La façade a été entièrement refaite (vers 1875 ?) en ciment moulé, opération à laquelle les cimentiers Gissler et Bember de Marseille ont participé avec le sculpteur marseillais Adolphe Royan. Les travaux ont été dirigés par l'architecte E. Poitevin

Le 14 octobre 1877, la chapelle a été rendue au culte. En 2023, le culte est autorisé à l'Institut du Christ roi souverain prêtre.